ترمال سایکلر و ریل تایم PCR

دستگاه Thermal Cycler PCR ( ترمال سایکلر پی سی آر )

همه ما در زمان پندمی کرونا با این نام آشنا شدیم و با ترس و دلهره به سراغ تست PCR رفتیم ، تستی که از بزاق دهان و مخاط بینی بیمار گرفته میشد . وقتی میخواهیم به هر دلیلی روی یک نمونه DNA تستی انجام بدهیم ، نیاز به مقدار زیادی از آن نمونه DNA داریم . برای این کار میبایست از نمونه خود کپی بگیریم ، برای تکثیر نمونه DNA میبایست آن را در توالی دمایی مختلف قرار دهیم تا نمونه ما تکثیر شود ، این امر با دستگاه پی سی آر میسر میشود . دستگاهی که ساختار پیچیده ای ندارد و تمام ماهیت آن دمادهی به نمونه از طریق پلتایر ، و قابلیت برنامه پذیری دقیق و دلخواه کاربر میباشد .

کلمه PCR مخفف Polymerase Chain Reaction  میباشد ، به معنی واکنش زنجیره ای پلیمراز ، با این روش میتوان به سادگی میلیون ها کپی از DNA خود تهیه کرده و مراحل بعدی آزمایش را ادامه دهیم . تا انتهای این مطلب همراه ما باشید تا همه چیز در مورد دستگاه PCR را باهم بخوانیم .

Thermal Cycler PCR چیست ؟

PCR که به صورت اختصار به دستگاه Thermal Cycler PCR میگویند. دستگاهی ست که توسط آن میتوان میلیون ها کپی از یک رشته DNA تهیه کرد . این کار در انواع تست های تشخیص هویتی ، تست های ژنتیکی و سلولی مولکولی ، تشخیص سرطان ، تشخیص بیماری هایی نظیر کرونا ویروس ، تشخیص بیماری های خاص ژنتیکی ، تست های غربالگری ، تستهای پیش از تولد نوزاد ، تشخیص بیماری های دام و طیور و دام بزرگ و آبزیان ، آزمایشات تحقیقاتی زیست شناسی و ده ها تست دیگر مورد استفاده قرار میگیرد .

این نکته بسیار حائز اهمیت است که این دستگاه جهت تشخیص استفاده نمیشود ، بلکه از مهمترین بخش های پیش از تشخیص بوده و جهت آماده سازی کپی های فراوان از نمونه اولیه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. از این رو خرید دستگاه PCR امری ضروری برای آزمایشگاه ها تلقی میشود و از جمله تجهیزات آزمایشگاهی مهم و ضروری به حساب می آید.

انواع PCR

دستگاه PCR ساده

با توضیحاتی که تا اینجا ارائه شده با این مدل از دستگاه آشنایی دارید .

دستگاه PCR گرادیانت ( Gradient PCR)

این دستگاه کاملا مشابه با نوع اول بوده ، با این تفاوت که در نوع اول ، دمادهی در تمام نقاط بلاک دستگاه به صورت یکپارچه بوده و تمام محفظه ویال ها یک دمای مساوی فرضاً 96 درجه سانتیگراد را در آن واحد دارند . اما در دستگاه با قابلیت گرادیانت این قابلیت وجود دارد که ، اگر حفره های میکروتیوب ها را به صورت 8 سطر و 12 ستون در نظر بگیریم ، بسته به مدل دستگاه میتوان دمای هر سطر یا هر ستون را با سطر یا ستون مجاور خود متفاوت دمادهی کرد . این دمادهی در بازه های دلخواه به صورت صعودی از اولین سطر یا ستون تا آخرین سطر یا ستون تقسیم بندی خواهد شد . بدین صورت که فرضاً در مورد دستگاه کمپانی DLAB مدل TC1000G این مثال را پیش ببریم ، در این دستگاه تقسیم بندی دمایی به صورت ستونی بوده و کاربر انتخاب میکند که اولین ستون دارای دمای 56 درجه و دوازدهمین ستون دارای دمای 68 درجه باشد ، دستگاه به صورت اتوماتیک اولین ستون را 56 درجه و دومین ستون را 57 درجه و سومین ستون را 58 درجه و الی آخر که آخرین ستون 68 درجه سانتیگراد دمادهی خواهد شد . این ویژگی در امور تحقیقاتی ، ساخت کیت ها و واکسن ها ، آزمایش انواع نمونه ها و تست های مختلف بسیار پر کاربرد خواهد بود و دستگاه PCR کمپانی DLAB از بهترین نمونه های گرادیانت حال حاضر بازار ایران به حساب می آید .

دستگاه Real-time PCR ( ریل تایم پی سی آر )

این دستگاه با عمده ترین تفاوت با دستگاه های قبلی ، یک سیستم تشخیصی بوده که جهت تعیین میزان بیان ژن های موجودت زنده مورد استفاده قرار میگیرد . در بیماری هایی نظیر کرونا ویروس، تشخیص قطعی بیماری با روش Real-time PCR انجام میشده .

طرز کار PCR

کار با PCR های نسل جدید بسیار ساده تر شده ، زیرا همه دستگاه ها مجهز به مانیتور لمسی بوده و تمام پروسه برنامه دهی توسط کاربر در این صفحه نمایش صورت میگیرد ، دستگاه های نسل جدید از رابط های کاربری ساده و جذابی استفاده میکنند که کار را برای هر کاربری با هر میزان از دانش راحت و میسر ساخته است .

آنزیم Taq Polymerase ، نوکلئوتیدها ، DNA نمونه و پرایمر ها به اضافه میکروتیوب 0.2ml تمام آن چیزیست که برای شروع کار با PCR مورد نیاز شماست . طرز برنامه دهی و زماندهی به دستگاه نیز طبق پروتکل کیتی که با آن کار میکنید برای کاربر دقیقا مشخص شده است . بعد از قرار دادن نمونه در میکروتیوب و چیدن آن در دستگاه ، کافیست پروتکل دمادهی با زماندهی مورد نظر کیت را در دستگاه setup کنیم .

برای شناخت محیط برنامه دهی و درک بیشتر این مطلب ، از صفحه دانلود دفترچه های راهنمای کاربری فارسی ، دستگاه Thermal Cycler PCR را دانلود کرده و طرز کار کامل با این دستگاه را مطالعه بفرمایید .

اجزای PCR

درب دستگاه ، روی نمونه بسته شده و از اتلاف انرژی و تبخیر نمونه ها جلوگیری میکند .
لید دمادهی از درب ، با دمادهی در حدود 100 الی 110 درجه از تبخیر نمونه جلوگیری میکند.
بدنه اصلی دستگاه ، شامل پوسته دستگاه و در بر گیرنده تمام اجزای دستگاه میباشد .
بلاک آلومینیومی ، یا متریال های مشابه به لحاظ انتقال دمایی ، محل اصلی قرار گیری میکروتیوب هاست .
مانیتور لمسی ، محل نمایش تمام اطلاعات دستگاه به اضافه اینکه کلیه دستورات از طریق همین مانیتور به دستگاه اعمال میشود .
هواکش هیت سینک ، محل گردش هوا برای خنک سازی هیت سینک های نصب شده در زیر بلاک .
پایه دستگاه ، که با متریال چسبنده کاملا به میز کار میچسبد و با پیچ های تنظیم میتوان دستگاه را تراز نگاه دارد

مراحل PCR

Denaturation

دناتوراسیون در دمای 96 درجه سانتیگراد اتفاق می افتد ، همیشه در ابتدای هر برنامه دهی دمایی این مرحله وجود دارد . در طی این مرحله با افزایش دمای محیط دو رشته DNA از یکدیگر جدا میشوند و مولکول های تک رشته ای به دست آمده در مرحله بعدی استفاده میشوند .

Annealing

مرحله اتصال ، که در بازه 55 الی 65 درجه رخ میدهد، در این مرحله با کاهش دما شرایط مناسبی برای اتصال پرایمر ها به توالی های بدست آمده خود مهیا میشود . در این مرحله همانند سازی دی ان ای در ناحیه مورد نظر اتفاق می افتد .

Extension

مرحله گسترش ، که در دمای 72 درجه سانتیگراد رقم می‌دهد ، در این مرحله با افزایش جزیی دما شرایطی برای فعالیت آنزیم Taq Polymerase و ساخت رشته DNA جدید فراهم میشود .

مراحل یک سیکل کامل PCR و برنامه دهی آن در جدول زیر به صورت ساده بیان شده:

تعداد سیکل مرحله دما مدت برنامه
1 Denaturation 95 درجه سانتیگراد 5 دقیقه
30 Denaturation 95 درجه سانتیگراد 30 ثانیه
Annealing 55 درجه سانتیگراد 30 ثانیه
Extension 72 درجه سانتیگراد 30 ثانیه
1 Extension 72 درجه سانتیگراد 10 دقیقه
1 Extension 10 درجه سانتیگراد بینهایت ( تا زمان مراجعه کاربر و خاموش کردن دستگاه )

کاربرد PCR

پس از ساخت میلیون ها کپی از رشته DNA مورد نظر خود ، میتوان آن ها را در موارد زیر مورد استفاده قرار داد :

شناسایی ژن‌های موثر در بیماری یا اختلال ژنتیکی
شناسایی علت بیماری عفونی
انواع تشخیص پزشکی
تکثیر یک قطعه از رونوشت ژن (Reverse Transcriptase PCR)
تست های تشخیص هویتی
کلونینگ DNA مورد نظر
تخمین دقیق تعداد نسخه‌های کپی یک ژن (Real-Time PCR)
محاسبه تعداد نسخه‌های کپی یک ژن در مقایسه با ژن دیگر (Semi-quantitative PCR)

نگهداری از PCR

مطمئن شوید که دستگاه خاموش شده و از منبع تغذیه جدا باشد
با یک پارچه نم‌دار و ملایم، سطوح بیرونی آن را پاک کنید تا از هر گونه آلودگی خارجی پاک شود.
با استفاده از یک حوله یا پارچه نم‌دار مرطوب شده با محلول ضد عفونی ملایم، تمام نواحی دستگاه را پاک کنید. محلول شامل الکل یا ایزوپروپانول باشد که به طور موثر باکتری‌ها و ویروس‌ها را از بین ببرد.
بلاک دستگاه را پس از خنک شدن کامل ، با گوش پاک کن تمیز نگه دارید .
ترجیحاً از ورود رطوبت به دستگاه جلوگیری شود ، الی الخصوص بخش های الکترونیکی .
همواره در نگهداری و مراقبت از صفحه نمایش به صورت خاص کوشا باشید .
از ضربه خوردن و خط افتادن روی بلاک جلوگیری نمایید.
از ضربه خوردن و ایجاد خط و خش روی درب لید جلوگیری بفرمایید.
از ضربه خوردن و ایجاد خط و خش روی مانیتور دستگاه جلوگیری بفرمایید.
دستگاه Realtime PCR ( ریل تایم پی سی آر )

در علم زیست مولکولی برای داشتن یک تصویر عمومی از کارکرد یک سلول نیاز است که فعالیت هزاران ژن به صورت یکجا بررسی شود . این بررسی یکجا از فعالیت هزاران ژن را بیان ژن می نامند . به عنوان مثال برای تشخیص واکنش یک سلول نسبت به یک درمان ، نیاز داریم تا پروفایل بیان ژن آن سلول را داشته باشیم . بسیاری از آزمایش‌های در این سطح، کل ژنوم را به صورت هم‌زمان، برای هر ژن، در یک سلول خاص اندازه‌گیری می‌کنند.

ظهور دستگاه ریل تایم اندازه گیری بیان ژن را به طرز بسیار چشم گیری آسان کرده است . در حقیقت Realtime PCR تکنولوژی جمع آوری اطلاعات در طول فرآیند PCR میباشد ، در نتیجه برای تقویت و تشخیص طیف گسترده ای از اختلالات و مشکلات ژنتیکی و سلولی و مولکولی و انواع بیماری های مختلف مورد استفاده قرار میگیرد . در ادامه همه چیز را در مورد ریل تایم بررسی میکنیم .

ریل تایم چیست ؟

به اختصار Realtime Polymerase Chain Reaction به معنی مشاهده لحظه به لحظه فرآیند PCR میباشد . دستگاه ریل تایم با مشاهده لحظه به لحظه فرآیند تکثیر DNA میتواند در به دست آوردن پروفایل بیان ژن بسیار مفید واقع شود . در نهایت پس از طی این روش در دو مرحله اصلی تقویت و تشخیص ، نموداری در خروجی کار به وجود خواهد آمد که هرآنچه مورد نیاز ماست را ارائه میکند .

انواع ریل تایم

دستگاه های ریل تایم بر چند اساس دسته بندی میشوند.

دسته بندی از نظر نوع Detector، که به انواع فوتومولیتور ، پرتو ایکس و فلورسانس میباشد
دسته بندی به لحاظ تعداد کانال دستگاه : مدل های دو کانال ، چهار کانال ، 5 کانال و 6 کانال
دسته بندی به لحاظ تعداد حفره بلاک : مدل های 16 خانه ، 36 خانه ، 48 خانه و 96 خانه
دسته بندی به لحاظ مانیتور دار بودن دستگاه یا کنترل از طریق کامپیوتر
دسته بندی بندی به لحاظ اقلام مصرفی ، به معنی Close بودن پلیت مصرفی و یا قابل استفاده بودن با تمام مصرفی ها
طرز کار ریل تایم

پروسه کاری ریل تایم قابل تقسیم به دو بخش تقویت و تشخیص میباشد .

تقویت
Denaturation

برای ذوب کردن زوج رشته DNA و تبدیل آن به دو تک رشته جهت تکثیر ، نیاز است که دمایی بالا در حدود 96 درجه سانتیگراد به رشته DNA مورد آزمایش القا شود . این روند را مرحله Denaturation می نامند . دناتوره شدن مولکول زیستی ، به‌ معنی از بین رفتن ساختار سه‌بعدی مولکول است. عملکرد بیومولکول‌هایی مانند پروتئین یا نوکلئیک ‌اسید ، مرتبط با ساختار سه‌ بعدی آن مولکولهاست ، در نتیجه دناتوره شدن عملکرد ماکرومولکول را از بین می‌برد اما بر توالی مونومرهای سازنده آن اثری ندارد.

Annealing

در این مرحله با کاهش دما در رنج 55 الی 65 درجه سانتیگراد،  شرایط مناسبی برای اتصال پرایمر ها به توالی های بدست آمده خود مهیا میشود . این مرحله Annealing  یا اتصال نام گذاری میشود . در این قسمت است که همانند سازی DNA در ناحیه مورد نظر اتفاق می افتد .

Extension

مرحله گسترش ، که در دمای 72 درجه سانتیگراد رقم می‌دهد ، در این مرحله با افزایش جزیی دما شرایطی برای فعالیت آنزیم Taq Polymerase و ساخت رشته DNA جدید فراهم میشود .

تشخیص

عمل تشخیص در ریل تایم مبتنی بر فناوری فلورسانس میباشد ، در علم شیمی  به پدیده ای که در طی آن، یك ماده خاص (فسفر) بعد از قرار گرفتن در مقابل تابش یا حرارت، تحریك می شود ( زمان تحریک کمتر از 10 به توان منفی 8 ثانیه ) و انرژی دریافتی را در خود ذخیره می كند. در نهایت آن انرژی را به شکل طیفی از امواج مرئی منتشر می كند.

نمونه ابتدا در میکروتیوب یا استریپ تیوب مورد نظر در دستگاه ریل تایم قرار داده می شود و مانند PCR معمولی تحت سیکلهای حرارتی قرار می گیرد.

در اینجا نمونه ما تحت تابش نور از منبع نوری دستگاه ریل تایم که از تنگستن ، هالوژن و یا LED  تامین شده است قرار میگیرد و منجر به فلورسانس ریجنت های نشانگری میشود که از قبل به نمونه خود اضافه نموده ایم ( مانند Cyber Green یا Eva Green )  . سیگنالی که از نمونه ساطع میشود توسط یک ماژول خوانش گر ( برای مثال در ریل تایم DLAB این ماژول از تکنولوژی فوق العاده پیشرفتهPMT استفاده میکند ) تبدیل به سیگنالی در حد میکروآمپر شده و توسط دستگاه ارزیابی و تجزیه تحلیل میشود و در خروجی دستگاه به صورت نمودار به نمایش درآمده و آماده تحقیق و بررسی توسط کاربر میشود .

اجزای ریل تایم

بدنه اصلی دستگاه
مانیتور دستگاه ( بسته به مدل آن میتواند با مانیتور یا بدون مانیتور باشد )
درب بلاک
بلاک دستگاه
پورت های ورودی و خروجی به کامپیوتر
کاربرد ریل تایم

در زمینه های مختلفی از قبیل تشخیص پزشکی برای انسان ، دامپزشکی ، کشاورزی  و دیگر صنایع  مورد استفاده است .

برخی از کاربردهای رایج دستگاه :

تشخیص بیماری : از ریل تایم برای تشخیص بیماری‌های مختلفی مانند HIV، هپاتیت ، کرونا ویروس و سرطان استفاده می‌شوند.
امور تحقیقاتی : برای تحقیقات آزمایشگاهی و طبی در زمینه‌های مختلف ژنتیک ، غربالگری ، ایمونولوژی ، سم‌شناسی ، تولید کیت های مختلف و تشخیص اختلالات سلولی استفاده می‌شوند.
کنترل کیفیت: برای کنترل کیفیت محصولات غذایی و دارویی
مفهوم CT در ریل تایم

اگر منحنی میزان تکثیر محصول در Real time یا PCR را بر حسب سیکل های PCR ترسیم گردد، می توان دریافت که به این منحنی  شامل سه فاز می باشد که عبارت است از:

در زیر منحنی میزان تکثیر در ریل تایم را بر اساس سیکل های PCR ترسیم کرده ایم ، این منحنی شامل 4 بخش است :

در این بخش میزان تکثیر به قدری نیست که باعث افزایش نور فلورسانس گردد و در حد کمی بیش از صفر و خطی میباشد .
تعداد تکثیر ها کمی بیشتر شده و منحنی رو به افزایش میگزارد .
تکثیر ها در هر سیکل دو برابر شده و منحنی شدیدا افزایشی میشود.
در این مرحله ریل تایم اشباع شدع و ترکیبات واکنش از بین رفته و دیگیر تکشیری اتفاق نمی افتد.

در تصویر فوق عدد CT معادل 19.2 ذکر شده . بدین معنی که فاز Exponential  (  فاز C  ) از این سیکل شروع شده .  هرچه عدد CT کمتر باشد به معنی بیشتر بودن بیان ژن و هرچه CT بیشتر باشد بیان ژن کمتری خواهیم داشت . همانطور که مشاهده فرمودین CT برگرقته از  Cycle Of Threshold به معنی سیکل آستانه میباشد .

مفهوم CT در ریل تایم

اگر منحنی میزان تکثیر محصول در Real time یا PCR را بر حسب سیکل های PCR ترسیم گردد، می توان دریافت که به این منحنی  شامل سه فاز می باشد که عبارت است از:

در زیر منحنی میزان تکثیر در ریل تایم را بر اساس سیکل های PCR ترسیم کرده ایم ، این منحنی شامل 4 بخش است :

جمع بندی

به نظر همه چیز در مورد Thermal Cycler PCR بیان شد ، برای خرید PCR و مشاوره قیمت PCR از نمایندگی PCR کمپانی DLAB استعلام بفرمایید . کلیه امور فروش دستگاه PCR را به ما بسپارید .

امروزه بسیاری از پیشرفت ها در زمینه علوم ژنتیکی چه در بحث تحقیقات و چه در بحث تشخیص به لطف دستگاه ریل تایم میسر شده است . شما نیز حالا به صورت کامل با این دستگاه آشنا شده اید . در صورتی که قصدی برای خرید ریل تایم دارید  ، میتوانید از طریق نمایندگی رسمی ریل تایم DLAB که متخصص در فروش ریل تایم میباشد اقدام بفرمایید

امروزه بسیاری از پیشرفت ها در زمینه علوم ژنتیکی چه در بحث تحقیقات و چه در بحث تشخیص به لطف دستگاه ریل تایم میسر شده است . شما نیز حالا به صورت کامل با این دستگاه آشنا شده اید . در صورتی که قصدی برای خرید ریل تایم دارید  ، میتوانید از طریق نمایندگی رسمی ریل تایم DLAB که متخصص در فروش ریل تایم میباشد اقدام بفرمایید .

کمپانی DLAB با ارائه دستگاه ریل تایم PCR خود با نام Accurate 96  توانسته است که تکنولوژی خود را به رخ بکشد ، این دستگاه با داشتن بلاک 96 خانه ، سیستم کنترل بر پایه ویندوز ، تجهیز به 5 کانال رنگی ، قابلیت NO Rox و کاربری بی نهایت ساده ، تبدیل به یکی از بهترین گزینه های خرید ریل تایم در ایران شده است ، حال آنکه شرکت راهیان نلم آزما نمایندگی انحصاری ریل تایم DLAB در ایران با ارائه گارانتی تعویض 2 ساله ، اطمینان خاطر صد چندانی برای دارندگان آن به ارمغان آورده است .